文獻(xiàn)背景

基本信息

摘要

研究?jī)?nèi)容及結(jié)果

1.UXT是CGAS-STING1信號(hào)通路的一種新型調(diào)控因子

2.UXT抑制CGAS-STING1信號(hào)響應(yīng)

作者研究了過表達(dá)UXT是否對(duì)CGAS-STING1信號(hào)通路有實(shí)質(zhì)性影響。通過轉(zhuǎn)染UXT表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行RNA-seq實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)UXT過表達(dá)和對(duì)照MEFs在cGAMP刺激后基因表達(dá)水平的分子變化。轉(zhuǎn)染成功實(shí)現(xiàn)了UXT的高效過表達(dá)(圖2A)。與UXT敲除的MEFs的結(jié)果相反，過表達(dá)UXT顯著下調(diào)了cGAMP誘導(dǎo)的大部分差異表達(dá)的ISGs表達(dá)(圖2B)。此外，顯著下調(diào)的基因在先天免疫反應(yīng)、免疫系統(tǒng)過程、細(xì)胞對(duì)干擾素-β的反應(yīng)等生物學(xué)過程中高度富集(圖2C)，其中大部分與UXT敲除實(shí)驗(yàn)重疊。為了進(jìn)一步證實(shí)這一點(diǎn)，作者通過real-time PCR驗(yàn)證了IRF3應(yīng)答基因及下游ISG基因的表達(dá)變化。在經(jīng)過cGAMP處理的UXT過表達(dá)MEFs中，Ifnb、Ifna4、Cxcl10、Isg15、Ifit1、Rsad2的表達(dá)顯著降低(圖2D,E)。此外，過表達(dá)UXT還可以抑制HTDNA或ISD觸發(fā)的IRF3-應(yīng)答基因和ISGs的表達(dá)(圖2F,G)，并減弱HTDNA和cGAMP誘導(dǎo)的IRF3磷酸化(圖2H,I)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明UXT是CGAS-STING1信號(hào)通路的抑制劑。

3.UXT缺乏增強(qiáng)了CGAS-STING1體內(nèi)信號(hào)響應(yīng)

UXT基因缺失導(dǎo)致胚胎早期死亡。為了進(jìn)一步證實(shí)UXT在CGAS-STING1信號(hào)通路中的作用，作者將loxP-flanked UXT純合子小鼠(UXTfl/fl)與表達(dá)Lyz2/LysM-cre的小鼠雜交，獲得骨髓細(xì)胞特異性UXT缺陷小鼠(UXTfl/flCre,UXT條件敲除[cKO])。為了檢測(cè)UXT缺失的有效性，作者通過western blot方法分析了對(duì)照組和UXT cKO BMDMs(骨髓源性巨噬細(xì)胞)上的UXT表達(dá)。在UXT cKO BMDMs中基本上沒有觀察到UXT信號(hào)(圖3A)，表明UXT在髓系細(xì)胞中被有效地敲除。然后從對(duì)照組和UXT cKO小鼠制備BMDMs，用cGAMP刺激。采用RNA-seq實(shí)驗(yàn)檢測(cè)cGAMP處理對(duì)照組和UXT cKO小鼠BMDMs基因表達(dá)水平的分子變化。結(jié)果表明，大多數(shù)在用cGAMP刺激后，UXT cKO BMDMs中差異表達(dá)的ISGs相對(duì)于對(duì)照組表達(dá)上調(diào)(圖3B)。UXT cKO BMDMs中顯著上調(diào)的基因在CGAS-STING1信號(hào)通路相關(guān)的生物學(xué)過程中強(qiáng)烈富集，包括先天免疫反應(yīng)、免疫系統(tǒng)過程和細(xì)胞對(duì)干擾素-β的反應(yīng)(圖3C)。根據(jù)RNA-seq數(shù)據(jù)，實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照BMDMs相比，cGAMP處理的UXT cKO BMDMs中Ifnb、Ifna4、Cxcl10、Isg15、Ifit1、Rsad2的表達(dá)顯著增加(圖3D,E)。當(dāng)使用HTDNA和ISD作為刺激時(shí)，也得到了類似的結(jié)果。此外，UXT的缺失促進(jìn)了HTDNA和cGAMP誘導(dǎo)的IRF3磷酸化(圖3F)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)證實(shí)了UXT在CGAS-STING1信號(hào)通路負(fù)調(diào)控中發(fā)揮作用。

在DNA-病毒感染小鼠模型的基礎(chǔ)上，作者進(jìn)一步研究了UXT的體內(nèi)功能。作者給UXT cKO小鼠和對(duì)照組同窩小鼠靜脈注射HSV-1，并監(jiān)測(cè)它們的存活率。UXT cKO小鼠感染HSV-1后的死亡率低于對(duì)照組(圖3G)。此外，在感染單純皰疹病毒1型(HSV-1)后，UXT cKO小鼠血清中IFNB蛋白的豐度明顯高于對(duì)照組小鼠(圖3H)。此外，UXT cKO小鼠在HSV-1感染后，清除病毒的能力增強(qiáng)，減少肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和組織損傷(圖3I)。UXT cKO小鼠肺和脾臟組織中Ifnb和Ifna4 mRNA的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(圖3J)。這些結(jié)果表明UXT在體內(nèi)負(fù)調(diào)控CGAS-STING1信號(hào)通路中的作用。

4.UXT在STING1水平上調(diào)控CGAS-STING1信號(hào)

為了確定UXT調(diào)控CGAS-STING1信號(hào)通路活性的分子機(jī)制，作者在HEK293細(xì)胞中過量表達(dá)UXT和CGAS、STING1、TBK1或IRF3 5D以及IFNB-熒光素酶報(bào)告基因。前期研究發(fā)現(xiàn)，CGAS-STING1-TBK1-IFR3軸的每個(gè)基因過表達(dá)均強(qiáng)烈激活CGAS-STING1信號(hào)通路，導(dǎo)致IFNB的誘導(dǎo)。因此，通過操縱UXT表達(dá)，同時(shí)過表達(dá)CGAS、STING1、TBK1或IRF3 5D，可以確定更特異的UXT調(diào)控的信號(hào)傳導(dǎo)事件。結(jié)果顯示，UXT可以減弱CGAS和STING1誘導(dǎo)的I型IFN信號(hào)，但不能減弱TBK1或IRF3 5D(圖4A)。作者只觀察到在UXT敲除細(xì)胞中CGAS和STING1介導(dǎo)的I型IFN信號(hào)通路顯著增加(圖4B)。在此外，UXT顯著影響cGAMP誘導(dǎo)的IRF3應(yīng)答基因的激活(圖1D,E，圖2D,E，圖3D,E)。由于CGAS和TBK1分別在CGAS-STING1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)軸中作用于STING1的上游和下游，這些數(shù)據(jù)表明，UXT在STING1水平調(diào)控CGAS-STING1信號(hào)介導(dǎo)的I型IFN信號(hào)。緊接著，作者驗(yàn)證了UXT對(duì)STING1的調(diào)控作用。共免疫沉淀和免疫印跡分析顯示，UXT與STING1特異相關(guān)，而UXT不與CGAS、TBK1或IRF3相互作用(圖4C)。作者發(fā)現(xiàn)UXT和STING1之間的關(guān)聯(lián)是動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的。HTDNA處理后，UXT與STING1發(fā)生相互作用，而HTDNA處理前，UXT與STING1的相互作用可以忽略不計(jì)，說明在激活CGAS-STING1信號(hào)通路后，UXT與STING1特異結(jié)合(圖4D)。在cGAMP刺激后的UXT和STING1免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中也觀察到了類似的結(jié)果(圖4E)。此外，作者進(jìn)行了鄰近連接實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)HTDNA刺激后UXT與STING1相互作用(圖4F)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)證實(shí)了UXT在CGAS-STING1信號(hào)激活后與STING1相互作用。

5. UXT促進(jìn)STING1的自噬降解

先前的研究報(bào)道，在CGAS-STING1信號(hào)激活后不久，STING1開始降解。作者注意到，HTDNA處理顯著降低了STING1的蛋白水平。發(fā)現(xiàn)UXT過表達(dá)導(dǎo)致HTDNA刺激后STING1的加速降解(圖5A)。當(dāng)使用ISD和cGAMP作為刺激時(shí)，也觀察到了類似的結(jié)果(圖5B,C)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些結(jié)果，作者在HTDNA刺激后測(cè)定了UXT敲除細(xì)胞中STING1的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)UXT敲除抑制了STING1的降解(圖5D)。此外，UXT敲除也阻礙了在ISD和cGAMP刺激后的STING1降解(圖5E,F)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明UXT促進(jìn)了STING1的降解。

在真核細(xì)胞中，蛋白質(zhì)降解主要依賴于兩條途徑：泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬-溶酶體途徑。作者進(jìn)一步研究了兩條通路中哪一條可能參與了UXT介導(dǎo)刺激后STING1降解。研究發(fā)現(xiàn)，自噬抑制劑3-MA(3-甲基腺嘌呤)和自噬-溶酶體抑制劑氯喹的處理可以恢復(fù)UXT過表達(dá)的STING1蛋白豐度下調(diào)，而蛋白酶體抑制劑MG132則不能(圖5G,H)，這表明UXT促進(jìn)了STING1的自噬降解。為了證實(shí)這一點(diǎn)，作者進(jìn)一步研究了UXT對(duì)自噬潮的影響，通過測(cè)定LC3的脂化，LC3是一種特征良好的自噬指標(biāo)，自噬活性增加后升高。結(jié)果顯示，在UXT敲除細(xì)胞中LC3-II顯著降低，在UXT過表達(dá)細(xì)胞中LC3-II顯著升高，說明UXT提高了自噬活性(圖5I)。此外，UXT介導(dǎo)的IFN信號(hào)抑制在自噬抑制細(xì)胞中也被*消除(圖5J)。綜上所述，這些結(jié)果表明UXT促進(jìn)了STING1的自噬降解，從而進(jìn)一步抑制STING1介導(dǎo)的I型IFN信號(hào)通路。

6.UXT促進(jìn)了SQSTM1和STING1的互作

作者繼續(xù)探索UXT如何調(diào)控STING1自噬降解。已知有四種自噬受體可選擇性靶向自噬降解蛋白：SQSTM1、NBR1、CALCOCO2/NDP52和OPTN(opti-neurin)。為了確定UXT介導(dǎo)的STING1自噬降解是由哪一種受體參與的，作者通過免疫沉淀和免疫印跡檢測(cè)UXT與這4種自噬受體的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，UXT與SQSTM1特異相關(guān)，而未觀察到UXT與其他三種自噬受體之間的相互作用(圖6A-D)。為了檢驗(yàn)這些發(fā)現(xiàn)的生理相關(guān)性，作者用HTDNA刺激細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在DNA模擬刺激后，UXT與SQSTM1強(qiáng)相關(guān)(圖6E)。此外，在cGAMP刺激后，UXT也與SQSTM1相關(guān)(圖6F)。總之，這些數(shù)據(jù)表明UXT在CGAS-STING1信號(hào)激活過程中與SQSTM1相互作用。此前有研究報(bào)道SQSTM1與STING1相互作用并介導(dǎo)STING1自噬降解。作者發(fā)現(xiàn)，在cGAMP刺激下，通過免疫沉淀和免疫印跡分析，SQSTM1與STING1相互作用。并發(fā)現(xiàn)UXT在HTDNA刺激后與SQSTM1和STING1同時(shí)相互作用(圖6G)。此外，作者還發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，UXT敲除細(xì)胞在HTDNA刺激后，SQSTM1和STING1的相互作用顯著降低圖6H)。當(dāng)使用cGAMP作為刺激時(shí)也得到了類似的結(jié)果(圖6I)。相反，在HTDNA或cGAMP刺激后，與對(duì)照細(xì)胞相比，在UXT過表達(dá)細(xì)胞中SQSTM1和STING1的相互作用顯著增強(qiáng)(圖6J,S4C)。為了進(jìn)一步確定UXT與SQSTM1和STING1相互作用的結(jié)構(gòu)域，作者利用一系列UXT的缺失突變體，發(fā)現(xiàn)UXT與SQSTM1-STING1相互作用需要UXT的N末端區(qū)域。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，UXT促進(jìn)了SQSTM1和STING1的相互作用，從而促進(jìn)了STING1的自噬降解。

7.UXT可緩解SLE患者的I型干擾素異常

SLE是一種常見的自身免疫性疾病，其特點(diǎn)是I型IFNs和ISGs的異常誘導(dǎo)?？紤]到UXT在調(diào)節(jié)STING1介導(dǎo)的I型IFN信號(hào)通路中的重要作用，作者研究了UXT在SLE患者中是否失調(diào)。作者對(duì)1211名SLE患者和139名健康者的4個(gè)大規(guī)模白細(xì)胞和PBMCs細(xì)胞基因表達(dá)譜進(jìn)行了整合分析。發(fā)現(xiàn)在所有四個(gè)獨(dú)立的SLE組中，UXT的表達(dá)均顯著受損(圖7A, Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，p<10e^?5)。UXT在SLE患者的T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞中均有下調(diào)，且沒有明顯的細(xì)胞型特異性(圖7B)。UXT的表達(dá)表現(xiàn)出與I型IFN信號(hào)強(qiáng)負(fù)相關(guān)，I型IFN信號(hào)是通過21個(gè)成熟的ISGs(也稱為21個(gè)IFNG信號(hào))測(cè)量的。在所有四個(gè)SLE組中，幾乎所有的比較中，UXT與這21個(gè)ISG基因的表達(dá)均呈顯著的負(fù)相關(guān)(圖7C,皮爾遜相關(guān)，F(xiàn)DR<0.05)，并且UXT與21個(gè)ISG基因的整體表達(dá)相關(guān)性顯著低于作為背景的四個(gè)SLE組(圖7D,Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，p<10e^?10)。基于這些觀察結(jié)果，作者研究了UXT表達(dá)是否可以調(diào)控SLE患者的I型IFN信號(hào)。從SLE患者的血液樣本中分離PBMCs，并通過電穿孔轉(zhuǎn)染空載體(Vec)或UXT表達(dá)質(zhì)粒(UXT)。轉(zhuǎn)染UXT表達(dá)質(zhì)?；蚱鋵?duì)照質(zhì)粒48 h后，UXT處理的SLE患者外周血單核細(xì)胞中UXT mRNA水平明顯高于Vec處理的SLE患者外周血單核細(xì)胞中UXT mRNA水平(圖7E)。在UXT處理的SLE患者PBMCs,IFNB和ISGs(CXCL10,ISG15,ISG54,ISG56)mRNA水平顯著降低(圖7F-J)，表明UXT減弱了SLE患者PBMCs中的I型IFN信號(hào)應(yīng)答。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明UXT可能是緩解SLE患者外周血單核細(xì)胞中異常I型IFNs的抑制因子。

作者進(jìn)一步研究了UXT在TMPD誘導(dǎo)的小鼠狼瘡模型中的作用，與對(duì)照組小鼠相比，UXT cKO小鼠TMPD誘導(dǎo)的ISGs如Ifit1、Ifit3、Rsad2、Isg15和Gbp6表達(dá)明顯增加，這與UXT對(duì)ISGs表達(dá)的負(fù)調(diào)控作用一致。狼瘡腎炎是SLE的病理特征之一，其特點(diǎn)是腎小球免疫復(fù)合物沉積和尿素氮和肌酐蓄積。作者觀察到，在TMPD治療后，UXT cKO小鼠的肌酐和尿素氮水平明顯高于對(duì)照組小鼠。此外，與對(duì)照組小鼠相比，UXT cKO小鼠腎小球IgG沉積也有所升高?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明，UXT缺乏導(dǎo)致了ISGs的表達(dá)增加，并在TMPD誘導(dǎo)的小鼠狼瘡模型中加劇了實(shí)驗(yàn)性狼瘡腎炎。

結(jié)論

索萊寶生化試劑盒貨號(hào)以“0"、“5"結(jié)尾，分別代表兩類反應(yīng)體系。以“0"結(jié)尾的代表試劑盒所用方法為分光光度法（反應(yīng)體系約1mL），可以用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)；以“5"結(jié)尾的試劑盒代表所用方法為微量法（反應(yīng)體系約0.2mL），可以用分光光度計(jì)或者酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)。