文獻背景
膀胱癌（BCa）是男性第四常見惡性腫瘤，也是女性常見的惡性腫瘤，復(fù)發(fā)風(fēng)險高。在BCa患者中，約75%為非肌肉浸潤性膀胱癌（NMIBC）。這些患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（TURBT）后進行膀胱內(nèi)化療或免疫治療。然而30-80%的NMIBC患者在初次手術(shù)治療后5年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，產(chǎn)生巨大的醫(yī)療費用。研究表明，不良復(fù)發(fā)的原因是TURBT不*，膀胱灌注效率低導(dǎo)致殘留腫瘤持續(xù)或再生。臨床上的膀胱內(nèi)滴注化療藥物，由于在尿液滯留和排泄過程中的周期性稀釋和沖洗，無法在殘留的腫瘤區(qū)域精確地維持持續(xù)有效的藥物濃度。盡管已經(jīng)開發(fā)了合并納米載體和藥物遞送系統(tǒng)以優(yōu)化給藥，但有限的療效和未滿足的安全性（如尿路梗阻和膀胱刺激的風(fēng)險）限制了其臨床應(yīng)用。因此，為準(zhǔn)確和*地殺死殘留的腫瘤，迫切需要智能和安全的膀胱內(nèi)制劑，即使在復(fù)雜的靜脈內(nèi)環(huán)境中也能實現(xiàn)精確的藥物富集和長期釋放。
臨床上，TURBT優(yōu)于膀胱內(nèi)灌注。TURBT手術(shù)床不同于正常的尿路上皮，是殘留腫瘤周圍的特殊環(huán)境。它提供一個現(xiàn)成的特異性靶向平臺，藥物可以定位并直接進入殺死潛在的殘留腫瘤細(xì)胞。雖然靶向手術(shù)床能夠?qū)堄嗄[瘤起到充分的殺傷作用，但膀胱這種pH值和滲透壓不斷變化的復(fù)雜液體環(huán)境，長期穩(wěn)定的靶向作用是其臨床應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)。由于失去了皮膚等表層屏障的保護，細(xì)菌感染更容易發(fā)生在手術(shù)或燒傷等傷口上。細(xì)菌感染對傷口的偏好可能為解決手術(shù)床定位問題提供新的思路。細(xì)菌感染由與宿主細(xì)胞的黏附引起，宿主細(xì)胞上的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）包括纖連蛋白（FN）、膠原蛋白、層粘連蛋白等通過細(xì)菌表面上的一組特定ECM附著分子為細(xì)菌直接黏附提供天然和多分子成分。在外部屏障被破壞后，損傷可能會暴露更多的ECM成分，從而增加穩(wěn)定細(xì)菌黏附的機會（方案1a）?？ń槊纾˙CG）是一種活的、減毒的牛分枝桿菌菌株，它可以通過手術(shù)特異性粘附于破壞的尿路上皮而不在正常的尿路上皮表面附著，這啟發(fā)作者實現(xiàn)膀胱手術(shù)床的特異性靶向。有文獻表明BCG特異性附著是由兩種成分介導(dǎo)的：BCG表面FN附著蛋白的FN結(jié)合肽（FBP）和TURBT手術(shù)暴露在手術(shù)床上的FN。
方案1
多肽除了具有生物相容性外還具有結(jié)構(gòu)和生物活性，是一種理想的生物材料。對多肽自組裝特性的研究不僅揭示了從納米粒子、納米纖維到納米網(wǎng)絡(luò)的一系列形態(tài)，而且拓寬了其在生物體中的應(yīng)用。作者代表性研究表明一系列自組裝肽可以在實體瘤中原位特異而牢固地形成3D纖維網(wǎng)絡(luò)，具有高蓄積性和長期滯留，用于歸巢治療藥物、抑制轉(zhuǎn)移等。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，自組裝肽基材料有望構(gòu)建理想的藥物遞送系統(tǒng)，即使在流動和沖洗的膀胱內(nèi)環(huán)境中，該系統(tǒng)也能在殘留腫瘤部位精確分布并延長滯留時間。
受細(xì)菌衍生的FN結(jié)合肽和暴露的FN之間的分子識別，特異性細(xì)菌粘附到傷口的啟發(fā)，作者將這種肽引入自組裝肽系統(tǒng)，并開發(fā)了細(xì)菌啟發(fā)的可轉(zhuǎn)化納米粒子（BTN）。BTN肽由三個基序組成：（1）FN結(jié)合肽（GNRQRWFVVWLG）作為靶向基序，（2）氫鍵肽（KLVFF）作為自組裝基序，（3）十二烷基鏈作為疏水基序（方案1b）。最初，BTN肽可以自組裝成納米BTN，并包裹阿霉素（DOX）以獲得具有十二烷基和KLVFF基序疏水核心的DOX@BTN。DOX@BTN的工作原理如方案1c所示。（1）細(xì)菌引起的粘連：首先將DOX@BTN膀胱內(nèi)給藥，并在術(shù)后手術(shù)部位暴露FN。DOX@BTN在FN結(jié)合肽的引導(dǎo)下精確靶向暴露的FN，從而附著在殘留腫瘤上。（2）轉(zhuǎn)化和藥物濃縮：疏水核心限制KLVFF堆疊在一起并形成組織良好的分子間氫鍵。一旦與靶標(biāo)FN結(jié)合，BTN的配體與FN之間的結(jié)合力就打破了BTN疏水親水平衡的限制，啟動了氫鍵肽之間的分子間氫鍵作用。因此，BTN從納米顆粒轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂?beta;-折疊二級結(jié)構(gòu)的納米纖維（NFs），進一步形成覆蓋殘留腫瘤的纖維涂層。NFs中的疏水域很容易通過疏水和π-π相互作用捕獲和儲存DOX，從而豐富手術(shù)部位中的化療藥物。DOX@BTN確保DOX的精確富集和延長釋放，不受周期性排尿的影響，直接有效地殺死殘留的膀胱癌細(xì)胞并減少膀胱癌的復(fù)發(fā)（方案1c）。
基本信息
摘要
不*手術(shù)留下的殘余腫瘤再生導(dǎo)致膀胱癌復(fù)發(fā)。術(shù)后膀胱內(nèi)灌注治療因藥物排空快、非特異性分布等原因，臨床對復(fù)發(fā)的抑制效果不理想。作者受細(xì)菌通過纖維連接蛋白結(jié)合肽與裸露傷口內(nèi)在黏附的啟發(fā)，開發(fā)了一種細(xì)菌激發(fā)的多肽納米顆粒，靶向手術(shù)中腫瘤殘留暴露的纖維連接蛋白。納米顆粒結(jié)合后轉(zhuǎn)化為纖維涂層，作為藥物儲庫長期釋放包裹的阿霉素。在灌注3天后，可轉(zhuǎn)化納米顆粒在小鼠膀胱內(nèi)保留的阿霉素濃度比游離的高8.5倍。在不*腫瘤切除模型中，這種配方明顯抑制了腫瘤的再生長。與臨床阿霉素治療相比，在小鼠原位膀胱癌模型中，它將復(fù)發(fā)率從71%降低到29%。這種生物材料不僅提供了一種膀胱內(nèi)治療方法，也為癌癥復(fù)發(fā)的臨床治療提供了機會。
研究內(nèi)容及結(jié)果
1.溶液中BTN與FN結(jié)合轉(zhuǎn)化行為的表征
根據(jù)固相多肽合成方法（圖S1），作者合成了FN可靶向和可轉(zhuǎn)化的C12-KLVFF-GNRQRW-FVVWLG型BTN多肽，以及兩個對照肽C1-BTN多肽（C12-KLVFF-GVRLWVQFRNWG）和C2-BTN多肽（C12-KAAGG-GNRQRWFVVWLG）。C1-BTN肽含有FN結(jié)合肽的自組裝基序，但不是靶向的擾亂序列。C2-BTN多肽具有FN靶向基序，但缺乏自組裝序列。因此，C1-BTN和C2-BTN都被設(shè)計成不能轉(zhuǎn)化為纖維結(jié)構(gòu)。采用快速沉淀法制備納米BTN和對照BTN（40μM，H2O:DMSO = 99:1，v/v）。作者嘗試探索包括FN結(jié)合肽的BTN是否保留了特定的FN靶向能力。從黏附陣列（圖1A）可以發(fā)現(xiàn)BTN和C2-BTN對預(yù)包覆的FN層的結(jié)合能力分別是C1-BTN（擾亂靶向序列）的2.7和2.4倍，表明FN結(jié)合肽賦予納米FN靶向能力。BTN與FN的結(jié)合能力分別是牛血清白蛋白（BSA）、膠原和層粘連蛋白的4.3、3.0和3.6倍，表明BTN具有與FN的特異性結(jié)合能力。另外通過分子動力學(xué)模擬預(yù)測了BTN在FN內(nèi)的結(jié)合域。FN的第13型結(jié)構(gòu)域（即FNIII13）在所選的FN結(jié)構(gòu)域（FN的7-10、11、12、13和14-16型結(jié)構(gòu)域）中范德華和庫侖相互作用能最大，表明BTN與FNIII13結(jié)合較強（圖S2）。然后，根據(jù)FN結(jié)合肽RWFV序列中結(jié)合能低、活性位點最多的位點，通過分子對接，篩選出較好的蛋白肽結(jié)合模型（即FNIII13-BTN肽）。目標(biāo)基序的VWLG序列與FN的T11，K19，I20，Y22，E23，E53，D55，A57之間發(fā)生了大的疏水相互作用（圖1b）。BTN肽和FN通過分子對接的代表性結(jié)合結(jié)構(gòu)，這種結(jié)合引發(fā)了BTN到納米纖維的轉(zhuǎn)化（圖1c）。
圖S1
圖S2
圖1
通過透射電子顯微鏡（TEM）和動態(tài)光散射（DLS）研究FN誘導(dǎo)的BTN轉(zhuǎn)變。添加FN在37℃下1小時，可觀察到平均直徑為10.8 nm的NFs，而在相同條件下，未添加FN的BTN仍保持納米級結(jié)構(gòu)（圖1d；圖S3）。無論是否在37℃下添加FN 1小時，C1-BTN和C2-BTN都只表現(xiàn)出納米形貌（圖S3）。單獨的FN在透射電鏡下既沒有完整的ECM呈現(xiàn)明顯的納米連接也沒有纖維狀網(wǎng)絡(luò)，而是呈現(xiàn)單體形態(tài)（圖S4）。BTN在37℃下與FN孵育1h后，其平均流體力學(xué)直徑從68.1 nm變?yōu)槎喾稚⒌?20.0和955.0 nm，表明BTN向非硝基氮化物轉(zhuǎn)變，但在沒有FN孵育的BTN溶液中只檢測到直徑的微小變化（圖1E）。DLS數(shù)據(jù)顯示C1-BTN和C2-BTN在直徑w/wo FN范圍內(nèi)變化不大（圖S5）。通過圓二色譜（CD）分析BTN多肽在轉(zhuǎn)化過程中的二級結(jié)構(gòu)。BTN與FN孵育1 h后CD信號特征明顯，在195 nm處CD信號為正，在216 nm處CD信號為負(fù)，表明BTN在FN誘導(dǎo)下通過氫鍵相互作用自組裝成富含β折疊結(jié)構(gòu)的NFs（圖1f）。但由于缺乏可變性C1-BTN和C2-BTN w/wo FN都沒有表現(xiàn)出典型的β折疊結(jié)構(gòu)特征信號。隨著BTN肽濃度的增加，BTN的CD光譜顯示出更多特征性的β折疊結(jié)構(gòu)CD信號（在195 nm處為正CD信號，在216 nm處為負(fù)CD信號）。根據(jù)CD光譜估計二級結(jié)構(gòu)，隨著BTN濃度從10增加到40μM，β-折疊二級結(jié)構(gòu)的比例升高，高于CMC（5.46 μM）（圖S6）。通過傅里葉變換紅外光譜（FTIR）進一步研究了所得NFs的詳細(xì)堆積結(jié)構(gòu)。FN孵育1小時后，BTN在酰胺I區(qū)1633cm-1處顯示出代表C═O拉伸振動的特征帶，表明NFs中存在平行β折疊結(jié)構(gòu)（圖1g）。富含β-折疊聚集體的熒光探針硫黃素T（ThT，10 μM）用于評估自組裝進展。于形成了β折疊結(jié)構(gòu)的神經(jīng)纖維，BTN+FN組的熒光強度比BTN組增加了4倍。在激光共聚焦掃描顯微鏡下，F(xiàn)N處理的BTN溶液中可見明顯的增強熒光的纏繞纖維聚集，表明形成了具有β折疊結(jié)構(gòu)的NFs（圖1H），而FN單獨處理組和FN處理的C1/C2-BTN組顯示出黑色的背景，沒有明顯的熒光集合體（圖S7）。通過分子動力學(xué)模擬研究BTN的形態(tài)轉(zhuǎn)變。在80 ns內(nèi)，BTN在FN誘導(dǎo)下呈現(xiàn)由粒子向纖維轉(zhuǎn)化的趨勢，而C1-BTN和C2-BTN的構(gòu)象沒有明顯變化（圖S8）。上述結(jié)果表明，BTN向NFs的轉(zhuǎn)化過程由GNRQRWFVVWLG與FN結(jié)合啟動，隨后KLVFF通過分子間氫鍵自組裝驅(qū)動。
圖S3
圖S4
圖S5
圖S6
圖S7
圖S8
2.體外BTN精確結(jié)合、自組裝和長時間滯留
在確認(rèn)轉(zhuǎn)化特性是由FN結(jié)合和兩個序列的自組裝雙重支配后（圖2a），用多細(xì)胞球狀體（MCSs）驗證FN的特異性粘附和向NFs的轉(zhuǎn)化。首先，用ELISA法檢測加入轉(zhuǎn)化生長因子-β的正常成纖維細(xì)胞L929和人胚胎腎細(xì)胞HEK293中FN的差異表達。經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子-β處理的L929細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分泌的FN是HEK293細(xì)胞的25.2倍（圖2B）。將TGF-β處理的L929細(xì)胞作為FN+組，HEK293細(xì)胞作為FN-組。Cy5標(biāo)記的BTN、C1/C2-BTN（40 μM，培養(yǎng)基:DMSO=99:1，v/v）分別與FN+或FN- MCS孵育1小時，用PBS洗去后用CLSM觀察。用Cy5標(biāo)記的BTN和C1/C2-BTN培養(yǎng)的FN-HEK293 MCS在沖洗后的熒光可忽略不計。相比之下，與Cy5標(biāo)記的BTN和C2-BTN孵育的FN+（L929 + TGF-β）MCSs顯示陽性熒光信號（圖2c），分別比Cy5標(biāo)記的C1-BTN孵育的MCSs高4.4倍和3.8倍（圖2d）。結(jié)果與結(jié)合試驗結(jié)果一致（圖1a），進一步證實了BTN的特異性FN結(jié)合能力。
圖2
作者進一步研究了BTN向NFs的轉(zhuǎn)化以及相應(yīng)的體外生物保留能力。將MCSs與Cy5標(biāo)記的BTN和C2-BTN共同孵育6h，分別于第0、1、2、3、4、5天觀察，每次觀察前更換MCSs的培養(yǎng)液。如圖2e和圖2f所示，在Cy5標(biāo)記的BTN和C2-BTN組中，在第一個時間點都檢測到比較熒光。C2-BTN組第二天熒光信號急劇衰減，第三天出現(xiàn)微弱的熒光信號，相比之下BTN處理的MCSs顯示出長期的熒光信號。第5天BTN組的剩余熒光強度仍達到初始熒光強度的60.1%，幾乎是C2-BTN組的兩倍（圖2e，f）。這種長時間的熒光可能是因為BTN轉(zhuǎn)化成的NFs型，它牢固地附著在MCSs上，耐洗滌并長期保留。為了驗證BTN的牢固附著，使用掃描電子顯微鏡（SEM）直接觀察經(jīng)BTN處理1h后的MCSs表面。在MCSs上觀察到纏繞的纖維網(wǎng)絡(luò)，可能是來自BTN的交織的NFs，驗證了牢固的附著。相比之下C2-BTN處理的MCS的表面呈現(xiàn)出相對光滑的外觀，表明C2-BTN在培養(yǎng)基更換期間被洗去（圖2g）。經(jīng)Cy5標(biāo)記BTN處理的L929 MCSs用ThT進行染色，CLSM圖像不僅顯示ThT在480 nm處的綠色發(fā)射熒光增強，而且與Cy5的紅色熒光共域，Pearson相關(guān)系數(shù)（PCC）為0.77，提示MCSs中具有β折疊結(jié)構(gòu)的NFs（圖2h）。C2-BTN組的ThT熒光顯示較低的PCC（0.56），Cy5標(biāo)記的C2-BTN熒光呈紅色，表明C2-BTN的β折疊結(jié)構(gòu)較少。綜上所述，這些結(jié)果表明BTN可在細(xì)胞微環(huán)境中與FN牢固結(jié)合，并在MCSs上自組裝成具有β折疊結(jié)構(gòu)的相互交織的NFs，從而延長滯留時間，可作為化療藥物的富集和緩釋庫。
3.小鼠膀胱內(nèi)BTN的靶向、轉(zhuǎn)化和滯留
為驗證TURBT手術(shù)前后靶向FN的定位，對C57BL/6小鼠和人的膀胱組織進行分析。小鼠模型采用鹽酸剝蝕損傷尿路上皮完整性的方法模擬手術(shù)對小鼠尿路上皮的損傷。小鼠膀胱組織免疫組化研究顯示FN位于完整的尿路上皮下，鹽酸剝蝕后出現(xiàn)在管腔表面。在正常和損傷的膀胱組織上用電灼法觀察到同樣的現(xiàn)象。這些結(jié)果表明術(shù)后FN將暴露在手術(shù)床上，驗證了靶標(biāo)的可靠性（圖3a，b）。以此為靶點進行一系列實驗，以評價BTN在體內(nèi)的結(jié)合、轉(zhuǎn)化和滯留情況。用酸剝離法損毀小鼠膀胱，然后分別注入染料標(biāo)記的BTN、C1-BTN和C2-BTN，每組3只。灌胃后1h處死小鼠，取膀胱組織進行免疫熒光染色。Cy5標(biāo)記的BTN和C2-BTN的紅色熒光出現(xiàn)在膀胱內(nèi)壁，并與FN熒光信號（綠色）有很好的共定位。與C1-BTN孵育的膀胱只有綠色熒光，幾乎沒有紅色熒光。（圖3C；圖S9）。利用體內(nèi)成像系統(tǒng)（IVIS）對體外膀胱的熒光成像，Cy7標(biāo)記的BTN組的熒光信號與Cy7標(biāo)記的C2-BTN組相當(dāng)，但比非靶向C1-BTN組高4.4倍（圖3D）。這些結(jié)果表明，纖維連接蛋白結(jié)合肽的FN靶向性有助于BTN和C2-BTN在體內(nèi)的積累。
圖3
圖S9
作者使用小鼠原位膀胱模型（n=3）進一步研究了BTN和C2-BTN在膀胱內(nèi)的滯留，該模型提供了具有動態(tài)流體環(huán)境的人類膀胱的真實模擬。將Cy7標(biāo)記的BTN和C2-BTN注入酸蝕的膀胱。膀胱區(qū)的熒光信號以時間依賴的方式被監(jiān)測和量化（圖3e，f）。BTN治療組膀胱內(nèi)熒光信號從4 h開始減弱，但速度相對較慢，在膀胱內(nèi)排尿時表現(xiàn)出較好的抗排尿能力，而C2-BTN組在注射后12 h內(nèi)迅速下降。BTN組在72 h仍可觀察到清晰的BTN熒光信號，而C2-BTN組在42 h后未見明顯的熒光信號。每組的保留效率以起始熒光信號的百分比為指標(biāo)，72 h時BTN組為21.0±5.7%，是C2-BTN組（3.2±0.9%）的6.6倍（圖3e，f）。在心、肺、脾等系統(tǒng)器官中，幾乎沒有熒光信號，表明BTN膀胱內(nèi)灌注的生物安全性（圖S10）。最后，使用Bio-TEM和掃描電子顯微鏡分別驗證了受損膀胱中的纖維涂層和交織纖維涂層（圖3g）。生物顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)BTN組大鼠膀胱內(nèi)壁表面有明顯的纖維結(jié)構(gòu)，而C2-BTN組大鼠膀胱內(nèi)壁表面無明顯纖維結(jié)構(gòu)（圖3h）。相應(yīng)的能量色散光譜（EDS）分析也鑒定了碘標(biāo)記的BTN多肽在纖維結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生的I特征信號（圖S11）。通過掃描電鏡觀察到BTN組擴張性膀胱壁呈纖維狀包膜（圖3i），而在C2-BTN處理的膀胱內(nèi)腔表面無纖維結(jié)構(gòu)，可見少量顆粒狀碎片。在活鼠膀胱中，BTN能精確靶向手術(shù)床自組裝成NFs，牢固地附著在膀胱內(nèi)表面。這些結(jié)果為活體小鼠手術(shù)床中BTN的高積累和長期滯留提供了直接證據(jù)，這對藥物的富集和持續(xù)釋放至關(guān)重要。
圖S10
圖S11
4.在模擬手術(shù)床中，DOX@BTN的DOX富集和長期釋放
據(jù)報道小分子傾向于通過疏水和π-π相互作用插入肽納米結(jié)構(gòu)中。BTN通過捕獲和儲存疏水性化療藥物，可作為一個藥庫。首先，用芘熒光探針法測定BTN和對照C2-BTN多肽的臨界膠束濃度（CMC）來評價包封性。BTN和C2-BTN的CMC值分別為5.46和11.13 μM，表明BTN比C2-BTN更傾向于膠束化，可能具有更強的包封效率（圖S12a，b）。DOX通過共組裝加載到BTN（DOX@BTN）和C2-BTN（DOX@C2-BTN）中。DOX@BTN和DOX@C2-BTN的紫外可見吸收光譜在485 nm處出現(xiàn)了DOX的特征峰（圖S12c，d）。與C2-BTN相比BTN的包封率（37.3% vs 26.3%）和載藥效率（27.2% vs 20.9%）分別提高了1.4倍和1.3倍，可能與BTN的疏水區(qū)域更大有關(guān)。分子動力學(xué)模擬顯示在80 ns時，DOX在BTN中比C2-BTN中分布更集中。DOX@BTN與DOX@C2-BTN相比，DOX的溶劑可及表面積（SASA）更低，說明BTN具有較高的包封能力（圖S12e）。以質(zhì)量比（BTN/DOX，0.16，0.5，0.6，1.1，1.6）為標(biāo)準(zhǔn)，采用透析法制備不同批次的DOX包埋BTN。隨著DOX含量的增加，載藥效率提高達到30%左右，包封效率降低（圖S12f）。為確定DOX負(fù)載納米顆粒的轉(zhuǎn)化性質(zhì)用透射電鏡和DLS表征在FN誘導(dǎo)下DOX@BTN、C1-BTN和C2-BTN的形態(tài)和尺寸分布。與未載藥的納米顆粒一致，只有經(jīng)FN處理1 h的DOX@BTN出現(xiàn)了明顯的由納米顆粒向納米纖維的形態(tài)轉(zhuǎn)變和DLS變化，盡管有FN誘導(dǎo)，DOX@C1-BTN、DOX@C2-BTN仍保持納米顆粒的形態(tài)，納米顆粒大小變化不大（圖4a；圖S13）。在與FN孵育1 h后，DOX@C2-BTN的顆粒尺寸變小，這表明FN結(jié)合可能介導(dǎo)了納米顆粒的解離。通過平衡透析繪制藥物釋放曲線，研究BTN向NFs轉(zhuǎn)化過程中DOX的釋放行為（圖S14a）。將DOX@BTN、DOX@C1-BTN和DOX@C2-BTN與FN混合后分別加入透析膜中。將DOX@BTN與FN（20nM）孵育2 h后，直接制備DOX@NFs進行透析。在FN的誘導(dǎo)下，DOX@C2-BTN（無自組裝基序）在120 h內(nèi)快速釋放了57.8%的DOX，而DOX@C1-BTN（FN結(jié)合肽的雜亂序列）在120 h內(nèi)釋放緩慢，釋放量最少（16.9%）。對于有NFs形成的組，DOX@BTN與FN和DOX@NFs混合后的DOX存儲量分別為71.9%和70.2%，顯示出DOX的持續(xù)釋放，長期藥物暴露殺死癌細(xì)胞。曲線顯示與DOX@NFs相比，DOX@BTN+FN在前4 h表現(xiàn)出相對較快的釋放，這一快速釋放階段可能是由于結(jié)合FN啟動了從納米BTN到NFs的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。C1-BTN的緩釋行為可能是由于FN失去了啟動轉(zhuǎn)化的靶向性。DOX@BTN+FN組在4 h后表現(xiàn)出緩釋特征，這意味著DOX仍然存儲在NFs中（圖S14a）。這些結(jié)果證實盡管通過FN結(jié)合增加了藥物釋放，轉(zhuǎn)化的NFs通過捕獲DOX在NFs中成為藥物保留的主導(dǎo)。計算包含DOX@BTN和FN在80 ns內(nèi)的均方根（RMSD）值。與DOX@C2-BTN-FN相比，DOX@BTN的RMSD變化較小，表明DOX@BTN具有緩釋性質(zhì)（圖S14b）。
圖S12
圖4
圖S13
圖S14
為了驗證DOX@BTN具有靶向和長期抗癌作用的*性，使用實時細(xì)胞分析（RTCA）來動態(tài)監(jiān)測DOX@BTN對細(xì)胞活力的影響，同時進行常規(guī)CCK-8檢測（圖S15）。圖4b演示了實驗方法。為提供豐富的靶細(xì)胞（FN）以便更好地轉(zhuǎn)化，在RTCA孔的底部預(yù)涂FN，然后接種膀胱癌細(xì)胞（MB49），*模擬了一個含有癌細(xì)胞殘留的體外傷口。DOX@BTN和游離DOX（臨床傳統(tǒng)治療方式作為對照）在MB49附著生長后添加。1小時后用無DOX培養(yǎng)液更換上清液以模擬尿液沖洗，同時記錄細(xì)胞存活率（圖4b）。兩組細(xì)胞存活率在 4h內(nèi)先略有升高，之后逐漸下降。DOX@BTN組的下降速度明顯快于游離DOX組。在72 h時，DOX@BTN對細(xì)胞活力的抑制作用明顯強于游離DOX（圖4c）。為證實在體外創(chuàng)傷模擬RTCA模型中是否形成了由納米纖維組成的纖維涂層，使用掃描電子顯微鏡觀察了預(yù)涂有FN的RTCA孔上的細(xì)胞（圖4d）。如圖4e所示，在DOX@BTN孵育1 h的細(xì)胞周圍觀察到成簇的纖維涂層，但游離DOX處理1 h后細(xì)胞仍保持黏附，沒有纖維涂層，由于沖刷，細(xì)胞背景清晰。培養(yǎng)上清與DOX或DOX@BTN孵育1 h后更換，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。掃描電鏡顯示DOX@BTN組細(xì)胞被纖維包膜覆蓋，細(xì)胞縮小碎裂，游離DOX組細(xì)胞與1 h時情況相似，背景清晰，無額外結(jié)構(gòu)（圖4e）。這些結(jié)果清楚地證明了在MB49細(xì)胞周圍形成由NFs組成的纖維涂層的證據(jù)，表明DOX@BTN通過與FN結(jié)合靶向并覆蓋MB49細(xì)胞，實現(xiàn)DOX的長期殺傷作用的持續(xù)釋放。
圖S15
基于在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)交織纖維涂層的高蓄積和長時間滯留，作者測試了纖維交織涂層對DOX的耐尿性和緩釋行為。酸蝕膀胱組灌胃阿霉素，同時灌胃游離阿霉素（0.5 mg/mL，相當(dāng)于920 μM）。收集尿液中釋放的DOX，在不同時間間隔內(nèi)進行測量（圖4f）。尿液中的DOX濃度反映了膀胱內(nèi)的藥物含量。經(jīng)膀胱內(nèi)給藥可使DOX在膀胱內(nèi)定位，直接到達癌灶，發(fā)揮最大的治療效果。如圖4g所示，游離DOX組在16 h內(nèi)快速排泄，導(dǎo)致藥物快速消耗。DOX@BTN組藥物排泄緩慢，24 h后尤為明顯。DOX@BTN處理膀胱排出的DOX濃度顯著高于未處理膀胱排出的DOX濃度。DOX@BTN處理后膀胱72 h釋放的DOX濃度為11.8 μM，仍高于游離DOX的IC50值（1.4 μM），是游離DOX對照組的8.4倍（圖4g，圖S15）。將DOX@BTN和游離DOX分別與電灼傷小鼠的體外膀胱孵育。與游離DOX組相比，DOX@BTN組開放膀胱在靶區(qū)即手術(shù)床上顯示出較強的DOX熒光，證實了手術(shù)床內(nèi)藥物的精確濃縮。DOX@BTN組手術(shù)床上DOX的熒光強度（信號）與正常膀胱壁（噪聲）的比值是游離DOX組的2.2倍（圖S16）。結(jié)果證實DOX@BTN通過與暴露的FN結(jié)合，能夠特異性地靶向手術(shù)床，并有效地保留了DOX在體內(nèi)的長期抗腫瘤作用。
圖S16
5.DOX@BTN對不*腫瘤切除模型的殘留腫瘤抑制作用
作者進一步評估了DOX@BTN對膀胱殘余腫瘤再生的抑制作用。首先，將MB49-Luc細(xì)胞移植到皮下制備異種移植瘤。14天后，腫瘤被摘除并縫合，留下可見微小腫瘤病變（不到原始腫瘤體積的1%）的空洞作為殘余腫瘤。手術(shù)后生物發(fā)光的顯著減少驗證了殘余腫瘤的成功制備（圖S17）。將四種制劑（PBS、DOX和BCG作為臨床對照，DOX@BTN）注射到切除腔中，然后在每次治療后用PBS沖洗，建立模型的步驟很好地模擬了臨床膀胱內(nèi)灌注的過程（圖5a）。DOX@BTN組6只小鼠中有2只在治療結(jié)束時未見明顯腫瘤，其余3組小鼠均腫瘤復(fù)發(fā)。PBS治療的腫瘤在不*切除后隨時間呈指數(shù)增長，在結(jié)束時間點平均腫瘤體積達到553.5 mm3。DOX組腫瘤生長明顯延遲，截止時間平均腫瘤體積為257.1 mm3。BCG組腫瘤被中度抑制，平均腫瘤體積為384.7 mm3，可能是由于人工腔內(nèi)缺乏免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)運所致。DOX@BTN顯示出對殘余腫瘤再生的有效抑制，平均腫瘤體積為100.7mm3（圖5b，c）。通過免疫組織化學(xué)和H&E染色證實了腫瘤摘除后腔內(nèi)殘留腫瘤負(fù)荷的豐富FN表達，成功模擬了不*TURBT后FN暴露的殘留腫瘤。因此DOX@BTN能夠結(jié)合并保留在手術(shù)床上進行精確的藥物釋放，對殘留腫瘤的復(fù)發(fā)具有優(yōu)異的抑制效果（圖5d；圖S18）。此外，DOX@BTN治療的小鼠體重幾乎沒有受到影響，并且顯著高于DOX組（圖5e）。所有結(jié)果證實轉(zhuǎn)化為NFs后的DOX@BTN可作為具有長期腫瘤殺傷作用的化療藥物庫，降低復(fù)發(fā)風(fēng)險。為評價DOX@BTN的安全性，在終點采集血樣和主要器官。測定血清ALT、AST、ALP、TP、ALB、GLOB、CRE、BUN等生化指標(biāo)。DOX@BTN組與PBS組無明顯差異，說明DOX@BTN組無系統(tǒng)性毒性（圖S19a-c）。多器官病理切片結(jié)果表明特異性富集和長期保留的DOX@BTN不會引起不良的病理改變（圖S19d）。
圖S17
圖5
圖S18
圖S19
6.DOX@BTN對小鼠原位膀胱癌復(fù)發(fā)的抑制作用
作者進一步研究了DOX@BTN在小鼠原位膀胱腫瘤模型中的療效（圖6a）。將MB49-luc細(xì)胞植入小鼠膀胱，用IVIS實時監(jiān)測小鼠的動態(tài)，通過生物發(fā)光成像記錄腫瘤生長（圖6b）。所有小鼠在腫瘤孵育后第3天的膀胱中都顯示出類似的微弱生物發(fā)光信號，這表明發(fā)育良好的微小腫瘤病灶模擬了最小的殘留腫瘤。為更好地刺激術(shù)后環(huán)境，用24-G留置針抓撓膀胱內(nèi)壁，使傷口更多地暴露FN。之后根據(jù)膀胱術(shù)后的臨床給藥情況，分別于不同時間點（第3、5、7、10、17、24天）將PBS、DOX、BCG、DOX@BTN 4種膀胱內(nèi)配方注入小鼠膀胱（n = 7）。PBS組小鼠腫瘤復(fù)發(fā)，7只小鼠中有2只在1個月內(nèi)死亡。BCG治療組小鼠腫瘤復(fù)發(fā)控制增強，復(fù)發(fā)率為57%，而游離DOX組為71%，這與TURBT后BCG在預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)方面優(yōu)于TURBT后化療的臨床結(jié)果相一致。與不*切除模型相比，原位模型中BCG療效的提高可能與更真實的生理條件有關(guān)，具有更好的藥代動力學(xué)特性和完整的生物活性，如血管正常，有利于抗原呈遞和免疫細(xì)胞的募集。這也可能是由于不*切除實體瘤，但切除了大部分實體瘤后，腫瘤負(fù)荷比治療前的原位模型更大。與其他組相比，DOX@BTN治療的小鼠明顯表現(xiàn)出腫瘤生長抑制。DOX@BTN治療明顯降低了腫瘤復(fù)發(fā)率，從71或57-29%（DOX或BCG vs DOX@BTN）（圖6c，d）。DOX@BTN治療對體重的影響與不*切除模型的結(jié)果一致（圖6e）。此外，DOX@BTN治療能顯著延長小鼠的生存時間。7只小鼠中有5只存活超過60天，而PBS組、DOX組和BCG組中存活天數(shù)分別為33、43和49天（圖6f）。這些結(jié)果表明，DOX@BTN通過FN靶點抑制原位膀胱腫瘤的復(fù)發(fā)表現(xiàn)出優(yōu)異的療效。為進一步證實癌殘留膀胱內(nèi)纖維涂層的形成，掃描電鏡觀察原位小鼠膀胱DOX@BTN組。膀胱解剖后經(jīng)大體檢查發(fā)現(xiàn)膀胱組織有腫瘤病變，經(jīng)HE染色得到證實。通過免疫組化染色驗證FN表達和暴露（圖6g;圖S20），纖維結(jié)構(gòu)分布在有腫瘤負(fù)擔(dān)的膀胱表面，這為原位膀胱癌模型中BTN從納米顆粒轉(zhuǎn)化為納米纖維提供了直接和有力的支持（圖6h）。
圖6
圖S20
結(jié)論
受細(xì)菌對傷口黏附的啟發(fā)，作者成功開發(fā)了一種細(xì)菌誘導(dǎo)的可轉(zhuǎn)化納米顆粒（BTN），用于預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)。負(fù)載藥物的BTN能夠通過細(xì)菌衍生肽（FBP）與暴露的FN結(jié)合，精確地粘附在殘留腫瘤的手術(shù)部位。在靶向FN的引導(dǎo)下，DOX@BTN轉(zhuǎn)化為纖維涂層，具有長期滯留作用，有助于DOX在殘留腫瘤中的持續(xù)釋放，達到精確殺傷的目的。作者建立了不*切除模型來模擬術(shù)后殘留腫瘤。在該模型中，DOX@BTN可明顯抑制腫瘤再生。在原位膀胱癌模型中，DOX@BTN組與傳統(tǒng)膀胱內(nèi)灌注（DOX）相比，復(fù)發(fā)率從71%降低到29%。大多數(shù)注射了DOX@BTN的小鼠至少存活了60天。這種BTN不僅為抑制膀胱癌的復(fù)發(fā)提供了一個全新的視角，而且也是*治愈膀胱癌的*佳臨床替代方案。在臨床實踐中，這種智能配方為管理其他實體腫瘤的復(fù)發(fā)提供了機會。
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