文獻背景
由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引起的冠狀病毒病 于2019年12月爆發(fā)，導(dǎo)致健康危機。SARS-CoV-2變異體的快速傳播表明，目前批準(zhǔn)的抗SARS-CoV-2藥物、中和抗體和疫苗的有效性存在局限性。盡管為藥物再利用做出了相當(dāng)大的努力，但治療和遏制SARS-CoV-2感染仍然需要有效抗病毒活性的新型化合物。SARS-CoV-2的感染需要將SARS-CoV-2的S蛋白的受體結(jié)合域（RBD）與宿主的細胞血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）的受體結(jié)合?？筍ARS-CoV-2中和單克隆抗體（mAbs）被設(shè)計用于與S蛋白的RBD或RBD-ACE2結(jié)合位點的表位發(fā)生靶向相互作用，或被選擇具有強大的中和活性，但是其需要對病人每kg體重用量為4-100毫克才能達到有效治療，儲存和運輸條件都較為復(fù)雜，且抵抗SARS-CoV-2變體幾乎無效，特別是針對奧密克戎。因此，需要尋找一種特異性相對較低且具有更廣譜治療能力的替代方法。
納米材料（NMs）的抗菌和抗病毒能力引起了作者的極大興趣。金屬NMs通過金屬原子與病毒組分的相互作用顯示出了抗病毒能力，例如金NMs具有可調(diào)的表面化學(xué)設(shè)計，其模擬病毒粘附的硫酸類乙酰肝素已成功應(yīng)用于抑制各種病毒的感染。由于RBD的β構(gòu)型和正表面電荷，RBD會優(yōu)先吸附在帶有大量負電荷的二維（2D）NM表面，于是作者篩選了一系列帶負電荷的NMs進行抗病毒活性研究。最后確定為超薄二維銅銦磷硫（CuInP2S6，CIPS）納米材料（NSs），其具有強大的抗SARS-CoV-2能力。
基本信息
摘要
嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）大流行造成緊急情況，只有通過有效和廣泛的預(yù)防和治療策略以應(yīng)對，而目前兩者仍然存在不足。作者研究了一種超薄二維銅銦磷硫（CuInP2S6，CIPS）納米材料作為抗SARS-CoV-2感染的新藥物。針對野生型SARS-CoV-2及其變體（德爾塔和奧密克戎）內(nèi)部的刺突蛋白受體結(jié)合域，CIPS展現(xiàn)出一個高的選擇性結(jié)合能力（解離常數(shù)（KD）< 1 pM），其能抑制病毒進入和感染攜帶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）的細胞、人呼吸道上皮器官和ACE2轉(zhuǎn)基因小鼠。在與CIPS結(jié)合后，SARS-CoV-2病毒被巨噬細胞快速吞噬和清除，這表明CIPS可以成功地用于捕獲和促進宿主清除病毒。因此，作者建議CIPS作為一種納米藥物，用于未來安全有效的抗SARS-CoV-2治療，并作為一種凈化劑和表面涂層材料來降低SARS-CoV-2的傳染性。
研究內(nèi)容及結(jié)果
1. CIPS在體內(nèi)外抑制SARS-CoV-2感染
通過掃描電鏡和透射電鏡測定，片狀剝落的CIPS具有多層結(jié)構(gòu)，平均尺寸為～200nm（圖1a），通過原子力顯微鏡測定，平均厚度為～3.1nm圖（1b，c）。根據(jù)擴展X射線吸收精細結(jié)構(gòu)（EXAFS）分析，銅原子與硫原子配位（圖1d），大部分Cu原子為+1價。硫以硫化物（S2-）的形式存在。銦原子的化學(xué)形式與CIPS的晶體結(jié)構(gòu)相一致，位于兩個不同的CIPS表面之間，通過與磷和硫原子配位，穩(wěn)定地支持CIPS的結(jié)構(gòu)（圖1e），銅、硫和磷原子主要定域在其表面，銦原子浸沒于其中。
作者評估了CIPS對真實SARS-CoV-2病毒的抗病毒作用。在CIPS存在的情況下，SARS-CoV-2感染Vero-E6細胞48小時后，SARS-CoV-2感染率以CIPS劑量依賴性的方式下降（圖1f，g），而細胞活力不受影響，選擇性指數(shù)（SI，細胞毒性和抗病毒，藥物濃度之間的比率）超過17.6（圖1g）。相位對比影像（圖1h）顯示，CIPS抑制了病毒誘導(dǎo)的細胞病變。用CIPS處理被SARS-CoV-2感染的Vero-E6細胞時，CIPS的抗病毒作用也很明顯（圖1i，j）：病毒感染24小時后加入CIPS仍能有效抑制體外SARS-CoV-2，病毒感染4小時后CIPS抑制作用最大。
圖1
CIPS的抗SARS-CoV-2效果采用了氣/液界面培養(yǎng)的人呼吸道上皮類器官模型（圖1k-n）進行了評估。類器官呈現(xiàn)出多層氣道上皮結(jié)構(gòu)，朝向空氣的一面是纖毛細胞，模仿人類呼吸道上皮的結(jié)構(gòu)。CIPS處理后，引起SARS-CoV-2復(fù)制減少40%（圖1k），同時有效保護了被SARS-CoV-2感染后嚴重破壞的組織完整性（圖1l，m）。SARS-CoV-2感染還引起上皮細胞厚度的增加，這是一個持續(xù)感染的跡象，而CIPS治療減少了這種情況（圖1n）。
作者評估了CIPS在人ACE2（hACE2）轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的抗SARS-CoV-2能力。小鼠鼻內(nèi)感染SARS-CoV-2前后用CIPS（每kg體重4-8mg）進行治療（圖2a，b），并在感染后3天評估肺中SARS-CoV-2的存在情況。2種劑量的CIPS治療均顯著降低了感染率（圖2a），CIPS在治療和預(yù)防方面均非常有效（圖2b)。組織損傷和白細胞浸潤（圖2c）、肺部炎癥因子的表達降低（圖2d），這些均證實了感染率的減少。
相關(guān)實驗也證明，CIPS對SARS-CoV-2的所有變體均具有很高的結(jié)合能力，CIPS可以有效抑制SARS-CoV-2變體的病毒感染。
圖2
2. CIPS對SARS-CoV-2的抑制機制
在排除了可能的金屬離子影響后（補充圖7），作者通過TEM（補充圖8a）、CIPS的理化性質(zhì)的變化（補充圖8b,c）和Western blotting（補充圖8d）證實了CIPS與SC2-P的相互作用。CIPS能有效地吸附和捕獲SARS-CoV-2病毒（圖3a、b）以及分離S蛋白。CIPS與S蛋白RBD具有非常高的親和力（解離常數(shù)（KD）<0.001nM，圖3c），而對其他血清蛋白和因子的親和力至少低100倍（圖3d）。在復(fù)雜的環(huán)境中（過量的小鼠肺勻漿或胎牛血清），CIPS對SC2-P的S蛋白保留了很強的結(jié)合能力和完整的抗病毒能力（圖3e，補充圖8h）其他二維納米材料（MoS2和氧化石墨烯（GO））顯示出明顯較低的RBD結(jié)合能力（KD=11.7和5.2nM，補充圖9）。它們的KD（CIPS?GO＜MoS2）與它們的抗病毒活性相關(guān)。擴展數(shù)據(jù)圖1b）。在RBD與ACE2的結(jié)合方面 (KD=11-17.4nM)，與報道的數(shù)據(jù)一致，如果RBD預(yù)先暴露于CIPS，即使在很低的測試濃度（15 fM；圖1）下，RBD與ACE2的結(jié)合也*被消除。測試濃度（15 fM；圖3f）。與商業(yè)化的mAb相比，CIPS的抑制能力顯著較高（圖3f 和補充圖10），通過計算抑制常數(shù)(Ki），CIPS為0.053 fM，而mAb為75pM。
通過分子動力學(xué)（MD）模擬研究了RBD在CIPS表面的吸附作用，利用ACE2和S蛋白的晶體結(jié)構(gòu)闡明了它們的結(jié)合界面，而與ACE2結(jié)合的RBD的氨基酸殘基被列在擴展數(shù)據(jù)中。用圓二色技術(shù)（CD）對存在或不存在CIPS時RBD的二級結(jié)構(gòu)進行表征，表明大部分RBD結(jié)構(gòu)以β-折疊構(gòu)象存在（圖3g）。由于β-折疊構(gòu)象促進了非結(jié)構(gòu)蛋白吸附，這可能解釋了RBD與CIPS的優(yōu)先結(jié)合。與CIPS結(jié)合后，RBD的構(gòu)象也發(fā)生了變化（圖3g），α-螺旋和旋轉(zhuǎn)構(gòu)象數(shù)量減少，β折疊構(gòu)象和隨機線圈增加。
圖3
3.CIPS促進巨噬細胞清除SARS-CoV-2
作者研究了病毒在與CIPS結(jié)合時是否能更好地吞噬和清除病毒。CIPS相關(guān)的SC2-P可以在培養(yǎng)24小時后被人巨噬細胞有效吞噬，并且病毒在隨后的降解過程中被有效清除（圖5a，b）。經(jīng)巴菲洛霉素（BM）溶酶體抑制后，SC2-P在巨噬細胞中積累（圖BM；圖5a，b），并與溶酶體共定位（圖5c)，這表明大部分SC2-P在吞噬溶酶體中被降解。同樣，用真實的SARS-CoV-2病毒進行的實驗表明，與CIPS結(jié)合的SARS-CoV-2病毒可以被巨噬細胞有效地吸收和清除（圖5d，e），而BM抑制溶酶體顯著增加了SARS-CoV-2的細胞內(nèi)水平，說明SARS-CoV-2的清除是溶酶體依賴性的（圖5e）。
作者研究了巨噬細胞對病毒的攝取是否只導(dǎo)致病毒的降解，是否也能導(dǎo)致細胞的感染。在使用SC2-P和真實的SARS-CoV-2病毒時，作者觀察到CIPS對病毒的攝取是依賴溶酶體的，對CIPS相關(guān)病毒的攝取并沒有引起巨噬細胞的感染，因為在培養(yǎng)中無法觀察到病毒的釋放。(圖5f,g）。這表明，巨噬細胞可以有效地攝取并清除與CIPS相關(guān)的SARS-CoV-2。巨噬細胞在CIPS促進的病毒清除的作用，在hACE2轉(zhuǎn)基因小鼠的體內(nèi)數(shù)據(jù)得到進一步證明。CIPS在抑制SARS-CoV-2復(fù)制的同時，增強了SARS-CoV-2和巨噬細胞在肺部的共定位（圖5h）。
使用透射X射線顯微成像結(jié)合納米計算機斷層掃描（Nano-CT）觀察細胞內(nèi)CIPS，顯示在暴露12小時后，細胞內(nèi)CIPS大量積累，在無CIPS培養(yǎng)基中48小時后，細胞內(nèi)CIPS顯著下降（圖5i）。根據(jù)電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）分析銦含量的結(jié)果顯示，巨噬細胞對CIPS的吸收是呈時間依賴性的，從培養(yǎng)基中去除CIPS后，銦含量隨時間的推移而降低（圖5j）。同時成像定量結(jié)果表明，CIPS被巨噬細胞降解。用Cu XANES譜分析來定量CIPS在巨噬細胞中積累和降解的化學(xué)變化。結(jié)果表明，Cu在內(nèi)化CIPS中的形式為+1價態(tài)，Cu以Cu-S的化學(xué)形式存在。隨著時間的推移，Cu在巨噬細胞中從+1價變?yōu)?2價，銅的化學(xué)形式從Cu-S到Cu-O/Cu-OOC（圖5k，l），這表明在細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運過程中，CIPS從氧化到降解，很可能在酸性吞噬溶酶體中發(fā)生。繼續(xù)監(jiān)測CIPS的生物分布和降解，顯示在肺內(nèi)6h積累最多，在7天后被*清除（圖5m，n），說明CIPS與巨噬細胞有明確關(guān)聯(lián)（圖5o）。
對巨噬細胞中CIPS依賴的病毒清除進行詳細的化學(xué)分析表明，在溶酶體樣酸性環(huán)境下銅離子（Cu+和Cu2+）促進過氧化氫生成羥基自由基。羥基自由基的強氧化能力可能會破壞病毒的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等成分（補充圖17a，e）。
為了研究針對SARS-CoV-2的CIPS的吞噬作用是否能促進保護性免疫，作者檢測了CIPS上調(diào)巨噬細胞活化和抗原呈遞相關(guān)分子表達的能力。與單獨暴露于病毒中的細胞作比較，CIPS上調(diào)了SARS-CoV-2處理的巨噬細胞中CD86和HLA-DRA的表達，這是抗原呈遞的兩個重要分子（圖5p）。這些結(jié)果表明，CIPS結(jié)合的SARS-CoV-2可以促進巨噬細胞中MHC II分子中的抗原呈遞，從而可能觸發(fā)適應(yīng)性抗病毒免疫應(yīng)答。
圖5
補充圖17
結(jié)論
2D CIPS NS作為一種有效的納米膠，通過結(jié)合病毒SARS-CoV-2的S蛋白選擇性捕獲這種病毒，從而抑制宿主細胞的感染。CIPS與SARS-CoV-2的S蛋白RBD的結(jié)合親和力小于1pM，形成了非常穩(wěn)定的復(fù)合物，并且有效結(jié)合了SARS-CoV-2 RBD中8個可結(jié)合ACE2的氨基酸殘基，從而有效地抑制了病毒的感染性。此外，SARS-CoV-2 VOCs所顯示的RBD突變并不影響其與CIPS的結(jié)合，表明CIPS在抑制病毒變體感染性方面具有廣譜性，其在體外和體內(nèi)的預(yù)防和治療策略中都有明顯的效果。綜上所述，CIPS是一種安全有效、具有良好生物相容性和生物可降解性的2D 納米材料，能夠抑制SARS-CoV-2的感染并促進清除（圖6）。
圖6
索萊寶產(chǎn)品亮點
相關(guān)產(chǎn)品
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BC1275 | Micro Protein Carbonyl Assay Kit |
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