熒光標記所依賴的化合物稱為熒光物質。熒光物質是指具有共軛雙鍵化學結構的化合物，當受到某一波段光照射時激發(fā)成為激發(fā)態(tài)，當從激發(fā)態(tài)恢復基態(tài)時可發(fā)出熒光。熒光標記技術是將熒光物質共價結合或物理吸附在所要研究分子的某個基團上，利用它的熒光特性來提供被研究對象的信息。熒光標記具有的無放射物污染、操作簡便等優(yōu)點，使其在許多研究領域的應用日趨廣泛，如免疫病理、細胞化學、流式細胞學。
索萊寶SAlexa Fluor熒光素抗體標記試劑盒中的SAlexa Fluor熒光素連接有N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）酯，NHS酯可以和伯胺反應，形成穩(wěn)定的共價酰胺鍵并釋放出NHS基團。一般一個IgG分子結合2~8個SAlexa Fluor熒光素分子可達到良好的熒光標記效果。
產品信息
試劑盒組分
組分 | 數量 |
SAlexa Fluor熒光素 | 1 |
pH調整緩沖液(0.1mL) | 1 |
1*PBS(1mL) | 2 |
DMSO(0.1mL) | 1 |
純化柱 | 2 |
收集管 | 2 |
試劑盒規(guī)格
一個試劑盒可標記100μg~2mg抗體
使用說明
01
抗體準備
1
建議抗體濃度調整到1~2mg/mL。
2
使用本試劑盒標記的抗體溶液，pH在6.5~8.5為宜，最好為PBS緩沖液。緩沖液中不應當含有BSA等蛋白，也不應當含有甘氨酸或Tris等含有游離氨基的鹽類，否則可能會影響標記效果。
02
抗體標記
1
取出SAlexa Fluor染料離心數秒，將管中干粉甩至管底。注：未離心前請勿開蓋，以免造成損失。
2
SAlexa Fluor管中加入40mL DMSO用漩渦混勻儀混勻10~20s，至SAlexa Fluor全部溶解，瞬離5~10s，使溶解后的SAlexa Fluor溶液離心至管底。
3
抗體中加入1/10體積的調整緩沖液。
4
將溶解后的SAlexa Fluor加入抗體中(每0.1mg抗體中加入2mLSAlexa Fluor)，用移液槍反復吹打混勻或用漩渦混勻儀混勻10~20s。
5
將抗體與SAlexa Fluor混合物置水平搖床或旋轉混勻儀，在搖動狀態(tài)下室溫避光反應1~2小時。
03
游離SAlexa Fluor染料的去除
1
將純化柱下方堵頭掰斷，1000×g離心1 min倒掉保護液，將純化柱移至新的收集管中。
2
將0.2 mL PBS加入管中，待全部滲入填料后，1000×g離心1min，重復2次。
3
將標記反應液加入到純化柱填料表面。如果樣品體積小于50mL，用試劑盒中的PBS補齊至50mL。上樣體積最大不要超過200mL。
4
待樣品滲入填料后，1000×g離心2min，收集純化的蛋白溶液。
5
將抗體標記物4℃避光保存待用。
04
標記抗體保存
標記抗體可4℃避光保存，也可以根據需要選擇加入BSA、防腐劑、甘油等成分保證產品穩(wěn)定。
*推薦保存液：0.01M PBS(pH7.4) 含1%BSA,0.03%
Proclin300和50%甘油，可-20℃保存一年。
05
染料-蛋白質比率的計算
1
用PBS稀釋少量標記蛋白。
2
使用路徑長度為1cm的比色皿，在280nm處測量吸光度和特定染料的Amax（見附表）
3
計算蛋白質濃度
C(mg/mL)={[A280-(Amax× Cf)]/1.4}×稀釋因子。
√C是染料-蛋白共軛物濃度；
√A280和Amax分別是在280nm處的吸光值以及在Amax波長處的吸光值；
√Cf是染料校正因子見附表；
√稀釋因子是在光度測量時的稀釋倍數
4
計算標記率的方法如下
DOL=(Amax×Mwt×稀釋因子）/(ε×C)
√C是染料-蛋白共軛物濃度；
√Mwt是IgG的分子量；
√ε是染料的摩爾吸光系數見附表。
注意事項
1. NHS酯類染料對水分敏感，SAlexa Fluor需現(xiàn)用現(xiàn)配；
2. 低濃度的疊氮鈉（0.02%）和10%甘油不會明顯干擾蛋白質的標記。但含有氨基的溶液及大于10%甘油對抗體的標記效率有較大影響。標記前應盡量去除干凈；
3. 試劑盒組份在運輸過程中可能造成顛倒，會使液體或干粉試劑沾到管壁或瓶蓋上。使用前請離心處理，以使附著管壁或瓶蓋的液體或干粉試劑沉積到管底；
4. DMSO屬微毒類，對人體皮膚有滲透性，眼有刺激作用，使用時避免與皮膚，眼睛和黏膜接觸。
附表
*：以nm為單位的激發(fā)波長
ε：Amax時的摩爾消光系數(M-1 cm-1)
Cf：校正系數(A280/Amax)
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