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正單鏈RNA(+ssRNA)病毒是自然界中含量豐富的真核生物病毒，需要使用基因組+RNA作為復(fù)制模板合成-RNA。植物和動物+ssRNA病毒的RNA中含有小的開放閱讀框(ORF)（反向ORF[rORF]）。利用蕪菁花葉病毒(Tumv)作為植物+ssRNA病毒的模型，證明了rORFs編碼的小蛋白具有特定的亞細胞定位，并通過質(zhì)譜分析證實rORF2在感染細胞中的存在。TuMV rORF2編碼的蛋白質(zhì)形成點狀顆粒，定位于核周區(qū)域，并與病毒復(fù)制復(fù)合體共定位。RORF2蛋白可以直接與病毒RNA依賴的RNA聚合酶相互作用，rORF2的突變消除了病毒的侵染，而rORF2的異位表達拯救了突變的病毒。此外，SARS-CoV-2的RNA具有抑制I型干擾素產(chǎn)生和促進水泡性口炎病毒侵染的作用。作者提供了TuMV可能利用內(nèi)部核糖體進入位點來翻譯這些小rORF的證據(jù)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明+ssRNA病毒的-RNA也可以具有編碼能力，其中編碼的小蛋白在病毒侵染中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

馬鈴薯Y病毒科、南方菜豆花葉病毒科、冠狀病毒科和黃病毒科病毒的基因組序列分析發(fā)現(xiàn)了許多編碼超過10個氨基酸的蛋白質(zhì)的ORFs，與+RNA中已知的ORFs類似，這些病毒的RNA在每個科內(nèi)選定的病毒子集中具有高度代表性（圖1A–D）。由于這些ORFs是在病毒+RNA的反向互補序列中預(yù)測的，所以將它們命名為rORFs（圖1E）。

在TuMV中鑒定出幾個小rORFs、rORF1-rORF4，并發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯Y病毒科中有大量匹配（圖1A和2A）。TuMV-rORF1–rORF3編碼的蛋白質(zhì)與黃色熒光蛋白(YFP)融合，定位于細胞核、核周區(qū)域和細胞質(zhì)，而rORF4僅限于核周區(qū)域（圖2B）。TuMV rORF1-YFP定位在葉綠體周圍，并與過氧化物酶體標記DsRed-SKL共定位，但不與高爾基體標記共定位（圖2C），與葉綠素自發(fā)熒光和ER標記mCherry-HDEL（his-asp-glu-leu在其N末端融合mCherry蛋白）的共定位發(fā)現(xiàn)TuMVrORF3-YFP在葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中（圖2D）。馬鈴薯Y病毒科復(fù)制發(fā)生在細胞質(zhì)膜結(jié)合的VRC中，在細胞核附近可以看到密集的塊狀物。使用表達青色熒光蛋白(CFP)標記的病毒RdRP(NIb)和mCherry標記的葉綠體定位膜蛋白(6K2)的TuMV-6K2-mCherry-CFP-NIb感染性克?。▓D2E），可以發(fā)現(xiàn)這些rORF編碼的蛋白質(zhì)在病毒侵染過程中被招募到VRC中復(fù)制（圖2F）。四種新蛋白均與6K2誘導(dǎo)的TuMVVRC和dsRNA共定位，這些rORF在病毒復(fù)制過程中VRC的形成和活性中具有潛在作用（圖2G-H）。

所有突變病毒在接種后60h時均呈現(xiàn)出明顯較少的RNA和蛋白質(zhì)積累（圖3A-C）。接種后5d和12d，TuMV-GFP-mrORF2未能在接種植物的全身組織中檢測到病毒RNA和CP；rORF1、rORF3或rORF4的突變對TuMV癥狀和病毒積累的影響較輕微（圖3D-H）。

除P3NPIPO外，rORF2蛋白與已報道的TuMV蛋白同時被檢測到（圖4A-B）。PVX-rORF2在28d時表現(xiàn)出嚴重的癥狀（圖4C）。此外，PVX載體表達的rORF2基因可以彌補接種TuMV-GFPmrORF2突變體的本氏煙草中rORF2的缺失（圖4D-F）。RORF2-YFP的轉(zhuǎn)基因表達恢復(fù)了TuMV-mrORF2-GFP的感染（圖4G-I）。

rORF2和11種典型TuMV蛋白酵母雙雜交(Y2H)測定發(fā)現(xiàn)rORF2編碼的蛋白質(zhì)與酵母細胞中的NIb相互作用（圖4J）。紅色熒光蛋白(RFP)-H2B轉(zhuǎn)基因本氏煙草植物葉子的雙分子熒光互補(BiFC)，證實體內(nèi)相互作用發(fā)生在植物細胞的細胞質(zhì)中（圖4K）。NIb與TuMV感染細胞VRC中的rORF2相互作用（圖2F和4K），進一步表明rORF2參與TuMV復(fù)制。

使用SARS-CoV-2作為模型（圖5A）推測由rORFs編碼的蛋白質(zhì)尺寸較小(<10kDa)，rORFs在SARS-CoV-2相關(guān)變體(VOC)中也保守（圖5B）。rORF3編碼的蛋白質(zhì)預(yù)計包含兩個跨膜結(jié)構(gòu)域（圖5C）。SARS-CoV-2 rORF編碼蛋白的GFP標記，三種融合GFP的rORF編碼蛋白均積累到相當(dāng)?shù)乃剑贖EK293T細胞中出現(xiàn)不同的亞細胞定位。GFP-rORF1分布在細胞核和細胞質(zhì)中，GFP-rORF2主要位于細胞核中，GFPrORF3主要分布在細胞質(zhì)中（圖5D-E）。

標記SARS-CoV-2的rORF1-3可以降低維甲酸誘導(dǎo)基因IRIG-IN誘導(dǎo)的干擾素β啟動子活性（圖6A）。SARS-CoV-2 rORF2和ORF6可明顯抑制外源干擾素-α誘導(dǎo)的ISRE啟動子的活性（圖6B）。

與表達GFP的細胞相比，表達N-FLAG的細胞中每個細胞可檢測的SG面積顯著減少，并且N蛋白與SG中的G3BP1共定位，表達rORF1-GFP和rORF3-GFP的細胞中SG形成顯著減少（圖6C和6D），表明rORF1和rORF3介導(dǎo)對SG形成的抑制。GFP-rORF1和G3BP1也共定位于NaAsO2處理細胞中的剩余SG（圖6C），表明rORF1可能通過與G3BP1相互作用隔離G3BP1來減弱SG形成。表達單個SARS-CoV-2rORF的細胞中VSV-GFP侵染的效率顯著高于對照細胞（圖6E-F）。

作者設(shè)計了一個雙順反子系統(tǒng)（圖7A）。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含有TuMV rORFs上游序列的雙順反子載體瞬時地表達到本氏煙草的葉片組織中（圖7B）。mCherry積累的差異不是由于mRNA水平的變化所致（圖7C）。用β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的序列取代驅(qū)動GFP-mCherry轉(zhuǎn)錄的35S啟動子（圖7D）。蛋白質(zhì)印跡分析表明無啟動子載體無法在本氏煙草葉子中表達GFP或mCherry（圖7E）。qRT-PCR分析表明35S啟動子驅(qū)動的表達mRNA產(chǎn)物在植物細胞中具有特異性條帶，表明不存在隱性剪接位點（圖7F）。