1.抗體的選擇
對于國內的大多數(shù)實驗室來講，做western blot實驗選擇抗體是個頭疼的問題。原因很簡單，買進口抗體捉襟見肘，買國產抗體得需要大無畏的勇氣，對于我所在的蘭州地區(qū)的實驗者而言，感觸尤深。在這五年的western blot實驗歷程里，我先后用過進口抗體，進口抗體國內分裝包裝，國產抗體，質量良莠不齊。
進口抗體一般不會出現(xiàn)閃失：abcam品種全，質量過硬，但價高（3400元/100微升），而且說是100微升，但多能吸出來90微升；的價貴；比較有性價比的是CST的抗體，現(xiàn)在好像是2200元/100微升，我前后用過二十幾種， 1:1000的稀釋比下，還沒有失過手，100微升通常能完成所有的免疫組化和western blot實驗，還有一個優(yōu)點是通常量比100微升多出來10微升，*的不足是CST的品種實在不多。Santa的多克隆抗體質量可以，但是選用Santa的單抗還是有風險，估計這也是業(yè)界共識了吧。
進口抗體國內分裝包裝我也用過不少，呵呵，畢竟是窮人（420元/100微升），大概好抗體的比例約為50%，如果能做出來，也存在一個問題，就是抗體大多只能用一次。我曾經把Santa的原裝抗體和分裝抗體做過比對（抗體品種，貨號等*一致），在都能做出來的前提下，原裝抗體能重復使用的次數(shù)要多出許多。具體原因我已經揣測了好幾年，不敢說出來，我一直在想是不是冬天西瓜切成牙和整個賣，也會有所不同。揣測歸揣測，假如只為了發(fā)論文畢業(yè)走人，可以考慮選用進口分裝的多克隆抗體。
國產抗體比較的就幾家，但質量確實不敢恭維。western blot能做出來的確實不多，而且雜帶多，背景不干凈。我們周邊的實驗室大多買國產抗體做免疫組化，怎么說呢，應付碩士論文夠了。
我也幫別人自制過抗體，再用抗原親和純化。效價非常不錯，夸張的時候1：10000都能做出條帶，*的麻煩是兔子太騷（騷臭），不知道這是不是“兔女郎”名號的來由。如果讀書非常悠閑，老板又特別想擁有手工作坊的情況下，可以自己伺候折騰兔子來玩玩，剛開始的時候還是蠻有成就感的。只是單憑抗原表達和制備多抗，是不是可以寫成論文畢業(yè)，估計因校而異了。
2.Western Blot設備
目前好的垂直槽和轉移槽還是Biorad（伯樂），尤其是MINI3好用,MINI4可以一次跑四塊膠，但通常用不上，由此造成垂直緩沖液的浪費，而且MINI4用綠色塑料夾住玻璃板來組成內槽，容易漏液，塑料夾應該是有疲勞壽命的，估計日子一長，彈性就會改變，所以如果你們實驗室剛買了MINI4，趕緊用，遭殃的肯定是某一級的師弟師妹們。
Biorad的一套系統(tǒng)得兩萬多，西部能玩得起伯樂的還真不多。好在咱中國人聰明，上海天能的外觀和構造和伯樂的MINI3幾乎一模一樣，而且可以通用，不帶電泳儀是5千多一套，挺好用的。*的不足是塑料壽命不如伯樂，膠架容易斷裂。不過仔細算算，三套天能也就是一套伯樂的價格，值了。北京六一的垂直槽很轉移槽很好用，但垂直槽配膠不方便，玻板太厚，散熱不好，但能用，六一的電泳儀（電源）還是很好用的。
3. Western Blot實驗條件
Western Blot實驗條件我基本是按ABCAM公司經典教材做的，按以下的下載下來就可以了（http://www.abcam。。ｃｏｍ/ps/pdf/protocols/WB-beginner.pdf）。具體的試劑配方我是按寶生物試劑冊的附錄部分配制。丙烯酰胺和甲叉我是從北京華美買的德國biomol原裝貨，配出來的膠可以提在手里玩，彈性非常好，價格比的便宜許多，1公斤好像是480多人民幣，夠實驗室用好長時間，現(xiàn)在我們實驗室做雙向電泳都用biomol的膠，很好用。Marker我現(xiàn)在用fermantas 的SM1811,2微升就很清晰了，蘭州的代理是上海生工。
要強調的是垂直電泳緩沖液千萬不能回收用，具體愿因你只需上網查查SDS-PAGE的原理就知道了。轉移電泳緩沖液可以回收再用兩次。
轉膜我通常是快轉兩百200毫安/2小時，慢轉80毫安/12小時。快轉是一定得做冰水浴，就是把槽子泡在冰水混合液里。
封閉我通常用BD的脫脂奶粉，不歸，260元500克，也是從北京華美買的。
ECL我用pierce的，500毫升1650元，比國產的還便宜好用。
膠片是柯達的，以前用過樂凱的，不如柯達。
我很少用麗春紅或考馬斯染膜或染膠，總覺得是脫褲子放屁的事。
4. Western Blot實驗關鍵
Western Blot操作步驟多，每一步的失誤都會造成全盤失敗，綜合而言，抗體仍然是決定成敗的關鍵，如果抗體很濫，就是*也沒招。其中內參抗體很重要，因為內參抗體的選擇關系到全盤實驗的考評。Actin，Tubulin，GAPDH我都用過，Actin，Tubulin的缺點是有時候會出現(xiàn)復帶，比較穩(wěn)定的還是GAPDH。如果用心看看cell，nature，science上的文章，大多用GAPDH做內參。進口的，國內分裝的，國產的，我都用過。進口的強的1:10000都能做出條帶（Upstate，現(xiàn)在被Minipore招安了），國內分裝的也好用，但就是不好回收重復使用，國產的一般只能用一次。我要特別強調的是，實驗室里貴的抗體實際上是內參抗體，因為只要Western Blot開工，每次都得用內參抗體，而一般目的蛋白的抗體也就用幾次，重復三次就了事。但內參抗體是不折不扣的耗材，嚴格意義上將，每跑一次膠，就得雜一次內參，使用頻率高決定了內參是花錢的抗體。我也自己制備過內參抗體，但好像因為種屬同源性太高，背景總是不干凈。進口的好，太貴；國產的只能使用一次，年終算賬，不比進口的便宜。我自己的體會是多抗制備并不是技術含量的事，為什么國內企業(yè)高的早不了，低的造不好呢？現(xiàn)在我用的是杭州賢的GAPDH兔多抗，200微升420元錢，我在蛋白上樣量12微升/孔的情況下，按1:2000稀釋比，條帶非常清晰，沒有雜帶，是我目前用過的好的國產抗體，我估計按1:4000照樣能做出來，因為按按1:2000稀釋做，在暗室里點上ECL后肉眼清楚地看到熒光條帶?？贵w我在不加*的情況下4度隔夜雜交，可回收重復使用5到6次。早我是2008年在丁香通上看到了杭州賢（當時名叫杭州松華）發(fā)布的廣告，我就慫恿實驗室主管買了2支，很好用，現(xiàn)在實驗室都沒有用完 ；2009年我的一個朋友做western，我推薦他又買了1支，做出來的效果確實好，2009年底我到了新的實驗室，western的全套我在新實驗室重新建立，啥都采購齊了，可就是買不到杭州松華的內參抗體，我上網再也找不到這個公司的網頁了，沒辦法，只好一直噌朋友的內參抗體用。我有個陋習，就是實驗中用順了用穩(wěn)定了試劑輕易不愿意更換品牌。還好，今年7月份我終于找到了當年的通訊記錄，一才知道他們改名叫杭州賢生物科技有限公司了，呵呵，改了個名，害我找了大半年。第三次買到的GAPDH內參抗體，還是好用，1:2000，條帶清晰，回收重復用，照樣work，截止目前，我的新導師對我采購的一堆試劑還沒有不滿意的，嘿嘿！草根出生，我也照樣有我窮人的勞斯萊斯。
5.關于奶粉，膜的選擇和顯影定影
奶粉看似簡單，其實很重要，如果要湊合，可以到超市買光明的脫脂奶粉。奶粉質量不好，會終導致顯影要么漆黑一片，要么啥都沒。fluka的很好，可惜因為瘋牛病的原因，現(xiàn)在海關禁止進口美國牛制品。我現(xiàn)在用的bd的，很好很穩(wěn)定，如果回收使用，500可以用很長時間。細菌達到一定極限后，會導致tbst里的奶粉變質，表現(xiàn)為發(fā)綠發(fā)臭，一種肉眼可察覺的淡淡的綠，一種鼻子湊過去能嗅出的臭，這時候就得扔了。
nc膜，pvdf膜我都用過，現(xiàn)在我已經固定下來用密理博的0.45微米的pvdf膜。pvdf膜的好處是蛋白載量大，韌性好。*的麻煩是事先得用甲醇泡幾分鐘，目的好像是為了增強膜的正電荷。甲醇泡完后，得在轉移緩沖液里泡一兩分鐘。國內用nc膜的人多一些，主要是因為nc膜有分裝的小片，忽悠老板買一張膜就100元錢，老板肯定樂意，若是說膜得花上千元，老板就有可能長時間的思考，然后過些日子再答復你。所以大多數(shù)人會采取前一種方式，當然得告訴老板好幾次，膜就100元錢。我*次用到pvdf膜是和好幾個實驗室合資買了一卷，我出了475元，類似于打的拼車的方式。現(xiàn)在pvdf膜國內大概是1600元到1700元一卷，33厘米*375厘米，夠好幾個人用好長時間了，膜假貨不多，少我沒有見過。我們幾個拼車的窮弟兄拿著尺子分贓的時候才發(fā)現(xiàn)本地供貨商給我們送的貨少了80厘米，嘿嘿，窮鬼攆著殺叫鬼，我們花錢容易嗎！所以交涉，再交涉，直到他把我們的血汗膜返還才罷休?，F(xiàn)在我基本是從北京的欣津科和華美買，大概1700元一卷，完完整整。
0.45微米的pvdf膜我用5%的脫脂奶粉（溶于tbst中）室溫封閉1小時，0.22微米的用8%的脫脂奶粉。bsa我很少用，主要是bsa會出現(xiàn)封閉不均勻的情況。我也很少用0.22微米的膜，原因是背景不干凈，再者無論是封閉時間還是洗膜時間都得延長。標準教程上推薦20kd以下的分子用0.22微米的膜，我雜過小的分子是cleaved-caspase3,12ka，按我在一樓的轉膜條件，在0.45微米的膜上清清楚楚。我在上海的師弟他們轉7ka的分子也用0.45微米的，沒出過事。廢話一句，我?guī)煹艿膶嶒炇铱墒菄抑攸c，那個富呀，讓我閉上眼想想吧，那可是屎殼郎掉到了化糞池的感覺。
一抗我一般4度搖床隔夜，洗膜3此，每次5分鐘。要注意的是，如果一抗里添加了*，務必洗膜5次，每次10分鐘，因為*會滅活二抗偶聯(lián)的辣根過氧化物酶（hrp）活性。二抗我用的是中杉金橋分裝的，120元一支，通常1:5000，室溫1小時，然后洗膜三次，每次5分鐘。
奶粉，一抗，二抗，我都回收，從開始到現(xiàn)在，一直如此。因為我不敢忘記自己賊的出身。我的一抗是國外的一位老師送給實驗室的，剛開始的半年我啥都做不出來，以于導師在平安夜領我到教堂祈禱。上海的師弟知道后，每次裁膜的時候給我一小片一小片日積月累了一些，二抗只拿到了10微升，我怕實驗室的人發(fā)現(xiàn)，一直是熬夜做western?？山K還是因為我自己嘴不牢靠，導致東窗事發(fā)，師弟險些被開除，事情敗露的那天，師弟在長途的那邊哭，我在這邊哭，寫著寫著，我的眼淚又一次的盈眶而出，說不出的辛酸與悲涼，師弟說他承擔一切責任，讓我裝作不知道，那天晚上，我給他的導師寫了一封長信，只求能保住師弟。老天保佑，他導師讓師弟寫檢查認錯。那以后，我再也沒有讓師弟為我偷過東西，我不能再為自己的理想讓朋友付出代價。雖然現(xiàn)在實驗室的老板比較大方，我依然堅持著回收試劑的習慣，我始終不能忘記自己western blot的開始。
一般8.3*4.3厘米的膜，大概要400微升的ecl混合液。加ecl我一般就在燈光下，或者白天把窗簾拉上。加好ecl，覆上保鮮膜后，我才端著暗盒進暗室，暗室里我的暗室紅燈始終開著，沒有那么可怕。在暗室里，我一般是剪4張同樣尺寸的膠片，疊在一起，壓在膜上方，暗盒一扣，就干別的事情去了。5個小時或隔夜，我再把膠片顯影，顯影我起初很注意技巧，但現(xiàn)在基本上是在顯影液里放10分鐘，撈出來放到水盤里涮一涮，然后在定影液里放十分鐘。我一般總能找到一張理想的膠片，因為膠片疊加到一起后，層層屏蔽，從而逐漸遞減熒光強度，我試過多次，即便是熒光強度強的內參，也多能達到上面的第四層膠片。所以顯定影后，肯定有曝光過度的膠片，但也肯定有趨勢，背景，強度恰到好處的一張，嘿嘿，傻瓜做法。
傻瓜做法看似呆笨，實則不然。我在很長的一段時間里，都是讀秒，或三分鐘，或15分鐘，或半小時，或1小時取出膠片顯影，眼睛緊緊盯著，一看到條帶就撈出來定影。如果不理想，再壓膠片，再等，再取再投再撈，活脫脫是個“猴埋兒”。西北人傳說小猴夭折了，母猴把小猴埋到土里面，一會又挖出來，再埋進去，又挖出來...反復無止。顯定影時如果采取猴埋兒式的技巧，是費膠片，費時間，費心力的做法。所以我是傻瓜就用傻瓜的辦法。
我用過好幾個品牌的國產ecl，和進口的ecl也做過對照。國產的一半是a液b液總共50毫升180元錢，單價3.6元/毫升，一般肉眼可見的熒光強度可持續(xù)1個小時，pierce和milipore的可以持續(xù)3小時。milipore的麻煩之處在于由a液b液c液三組成分組成，費槍頭，費腦子?，F(xiàn)在我固定使用pierce的super ecl，1650元500毫升，折算下來是3.3元/毫升。上海吉泰是代理。好像分子克隆上寫出了ecl的配方，技術含量并不高，
膠片我用過醫(yī)院放射科的，樂凱的，柯達的，柯達現(xiàn)在小膠片（小暗盒尺寸）好像是130元/50張，樂凱的是其價格的一半。樂凱的缺點在于膠片容易出現(xiàn)劃痕，有莫名奇妙的背景，雖然瑕不掩瑜，但還是讓人不爽，再就是感光不如柯達的靈敏。這些我都比對過。如果細心地把二者膠片厚度比比，也可看出差距。我就此請教過甘肅的樂凱總代理，他說根源出在牛身上。
顯影液定影液我一直用樂凱的，便宜，量又足，誰用誰說好。進口的從未染指，連想都沒想過，呵呵，我內心里還是極其渴望支持國貨的，愛之深，恨之切啊！
6.總結
從2005年*次見到抗體到現(xiàn)在，我已經做western blot實驗整整五年了。五年里，太多的磨難，太多的驚喜，太多的感觸，太多的代價。現(xiàn)在我做博士后，我指導的學生也能一次就上手，雖然他們也會出錯，但我很少責備他們，因為我知道自己的路途也并不順利，如果過度的責難他們，會讓他們失去信心，而且更嚴重的是會導致他們遮遮掩掩，我從來不怕實驗做不出來結果，就怕查不出失敗的原因。
我喜歡western blot技術，甚偏愛或癡迷。夸張的時候是連跑帶轉了八張膜，實驗不順利的那兩個月我天天就睡在實驗室里，有時候三天三夜不睡覺。我不知道自己借了多少錢從丁香園的二手資源版淘過別人用剩的抗體，今我穿的貴的褲子也就80元錢，但花1000元買抗體我從來沒有覺得破費。好在我的家人和朋友們理解我，支持我，讓我能逐步實現(xiàn)自己的愿望。五年里，從器具，試劑，儀器，甚如何用濾紙，我都形成了自己的體系和訣竅，我的一切東東都有品牌，這些品牌組合起來就是窮人的勞斯萊斯。
回想過去，內心仍然會浸沒到悲涼與辛酸中。難受的時候是做p21抗體，整整半年，從丁香園淘了五個品牌的抗體，都做不出來。后逼著導師買cst的抗體，還是不出，那時候正好是2008年雪災，抗體在公路上走了半個月，我收到抗體是大年初二，興奮地上樣，轉膜，還是沒有，當時我感覺自己就好像浸沒在冰窖里。宿舍里暖氣不好，第二天我起床時，房子里的洗臉水都已結冰，和我的心緒一模一樣。好在上海吉泰是一級代理，讓我投訴，cst美國總部發(fā)回來他們的蛋白陽性對照品，再試，p21出來了，是個印度人，一眼就看出來我沒有用超聲波裂解。我們實驗室沒有這個東東，我怎么就想不到問題就出在這呢！從投訴到解決問題又是兩個月。因為western，造成我博士延期一年半，害得師弟差點被開除，這也是我主動和導師關系疏遠的開始。
但我還是癡迷western，在我心里，western blot技術本身就是窮人的勞斯萊斯。跑一次膠，我一次可以在兩張膜上裁切出13種分子，我想不出還有哪項技術能一次實現(xiàn)如此之多的指標。Western穩(wěn)定，直觀，看著膠片上那粗細濃淡變化的條帶，就好像自己置身細胞內部，看著那些分子組合跳舞。我內心里一直非常感激當年饋贈抗體的那位老師，是他讓我踏上了信號轉導的道路，也是因為western，我一度和他幾乎決裂。在做western之前，我看文獻幾乎只看review，因為我看不懂實驗性論文的圖片，也正是做western，我才開始真正的踏上科研道路。我逐漸能看懂IP,CO-IP,EMSA,CHIP，我有了更多的夢想與愿望。五年中，我得意的是陪著western blto的發(fā)明人喬治斯塔克(George R. Stark)院士去敦煌玩,老頭年過70，動過心臟手術不久，仍然堅持赤腳爬上陡峭的鳴沙山。我們登頂歇氣時，老頭一聲不吭地又從山頂一步步走下去，從半山腰挖什么東西，等他再上來，我們才看清楚，他手里拿著兩個游客隨地扔棄的礦泉水瓶子。老頭一直把那兩個國貨拎到了山下的垃圾箱里。這是老頭給我深刻的記憶，境當謀高遠，一個人的精神境界決定了他專業(yè)道路的高遠。
從western實驗我總結出，實驗上根本省不下來錢，一個環(huán)節(jié)的爛貨就會導致全盤失敗。對于實驗設計而言，也是如此，一個步驟的bug會導致整個實驗立題和評估的邏輯混亂。如果要追求性價比，也就是如何發(fā)揮窮人的勞斯萊斯的大收益，那從一開始就要按秋后算賬的原則選擇試劑，要算總賬；如果要讓實驗順順利利，那就得注意每一個環(huán)節(jié)，步步為營，細節(jié)決定成敗。到現(xiàn)在，只要抗體work，幾乎沒有我做不出來的分子，western給了我無窮的自信。
